EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Materialien — Ein Bacillus subtilis Stamm, der das Plasmid pBSMuL3 enthält, das die F. solani pisi Cutinase enthält, wurde freundlicherweise von Dr. Thorsten Eggert zur Verfügung gestellt. Das EZ-10 Spin Column Plasmid Mini-Preps Kit, Agarose Gel DNA purification Kit, Restriktionsenzyme und T4 DNA Ligase wurden von TakaRa Biotechnology Co. Ltd. Die Plasmide pMD18T-simple und pET20b(+) wurden von Novagen erhalten. Natriumtaurodeoxycholat, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid, pNPB und Pseudomonas sp. MIS38-Lipase (PsL) wurden von Sigma erhalten. Andere Chemikalien wurden von Sinopharm Chemical Reagent Co. erhalten. Ltd. Phenyl-Sepharose FF- und DEAE-Sepharose FF-Harze wurden von Amersham Biosciences erhalten. Cellulase und Pektinase wurden von Wuxi Boli Biotechnologies Co. erhalten. Ltd. DNA-Primer wurden von Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co. Ltd. Die DNA-Sequenzierung wurde von Shanghai Generay Biotechnology Co. durchgeführt. Ltd.
Kultur von T. fusca – Der T. fusca-Stamm stammt aus Laborbeständen. Die Zellen wurden bei 50°C unter Schütteln bei 200 upm gezüchtet. Das Saatmedium (pH 8,0) enthielt 20 g/liter lösliche Stärke, 10 g/Liter Rindfleischextrakt, 5 g/Liter Hefeextrakt, 2 g/Liter K2HPO4 und 5 g/Liter NaCl. Das Fermentationsmedium (pH 8,0) enthielt 7,5 g/Liter Natriumacetat, 5 g/Liter Pepton, 7,5 g/Liter Hefeextrakt, 2 g/Liter K2HPO4, 5 g/Liter NaCl und 1 g/Liter Cutin.
Isolierung und Reinigung einer Cutin-induzierten PNPB-Hydrolase aus T. fusca-Zellen wurden aus der Cutin-induzierten Kultur durch Zentrifugation (40.000 ×g, 20 min, 4°C) entfernt. Der Überstand wurde langsam mit festem (NH4)2SO4 bis zu einer Endkonzentration von 70% (w/v) versetzt. Das ausgefallene Protein wurde zentrifugiert (40.000 ×g, 30 min, 4°C), sofort in Puffer A (20 mm Tris-HCl, pH 8,0) gelöst und über Nacht bei 4°C gegen 2 Liter Puffer A dialysiert. Die dialysierte Probe wurde mit festem (NH4)2SO4 bis zu einer Endkonzentration von 20% (w/v) versetzt. Die Probe wurde filtriert (0.22 µm) und auf eine mit 20% (NH4)2SO4 in Puffer A voräquilibrierte Phenyl-HP-Sepharose-FF-Säule geladen. Über einen Zeitraum von 60 min wurde ein umgekehrter Gradient von 20 auf 0% (NH4)2SO4 in Puffer A mit einer Flussrate von 1,0 ml/min appliziert. Die Fraktionen mit pNPB-Hydrolase-Aktivität, die wie unten beschrieben untersucht wurde, wurden gepoolt und über Nacht gegen 1 Liter Puffer A dialysiert. Die dialysierte Probe wurde auf eine mit Puffer A voräquilibrierte DEAE-Sepharose FF-Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit einer Flussrate von 0,8 ml/min unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 1 m NaCl in Puffer A über 100 min eluiert. Die Fraktionen mit pNPB-Hydrolase-Aktivität wurden gepoolt und über Nacht gegen 1 Liter Puffer A dialysiert. Das Endpräparat wurde durch Ultrafiltration (Centriprep YM-10 Konzentrator) auf 1 mg/ml aufkonzentriert und bei -80°C gelagert.
Peptid-Massen—Fingerprinting-Analyse und N-terminale Aminosäure-Sequenzierung – Die Proteinbande, die der Cutin-induzierten PNPB-Hydrolase entspricht, wurde aus dem SDS-PAGE-Gel herausgeschnitten und einer Peptid-Massen-Fingerprinting-Analyse und N-terminalen Aminosäure-Sequenzierung unterzogen. Die Peptidmassenfingerdruckanalyse wurde mit dem Proteomics Solution I-System durchgeführt und die N-terminalen Reste wurden mit der Edman-Methode mit dem Applied Biosystems Model 492cLC Protein Sequencer sequenziert. Beide Analysen wurden von Shanghai Gene Core BioTechnologies Co. durchgeführt. Ltd.
Klonierung, Expression und Reinigung von Tfu_0882 und Tfu_0883-Die Gene, die für die reifen Formen von Tfu_0882 (NCBI accession number YP_288943) und Tfu_0883 (NCBI accession number YP_288944) kodieren, wurden aus T amplifiziert. fusca genomische DNA durch Standardpolymerase-Kettenreaktionsmethoden unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase. Da die N- und C-terminalen Nukleotidsequenzen der beiden Gene identisch sind, wurden die gleichen Primer verwendet. Der Vorwärtsprimer war GGAATACCATATGTCCATGGCCAACCCCTACGAGCGCGG (NcoI unterstrichen) und der Rückwärtsprimer war CATCTCGAGAGAATTCGGGAACGGGCAGGTGGAGCG (EcoRI unterstrichen). Das Amplifikationsprodukt wurde isoliert und in den Vektor pMD18T-simple ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um chemisch kompetente Escherichia coli JM109 Zellen zu transformieren. Das aus diesen Transformanten isolierte Plasmid wurde durch Restriktionsanalyse verifiziert und die Gensequenz durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Plasmide mit den korrekten Sequenzen von Tfu_0882 und Tfu_0883 wurden Tfu_0882-pMD18T bzw. Tfu_0883-pMD18T genannt. Da beide Gene eine interne NcoI-Stelle enthalten, wurde eine ortsgerichtete Mutagenese durchgeführt, um diese Stellen zu eliminieren, während die codierte Aminosäure unverändert blieb. Die resultierenden Plasmide wurden mit NcoI und EcoRI verdaut und in den ebenfalls restriktionsverdauten Expressionsvektor pET20b(+) ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um chemisch kompetente E. coli JM109 Zellen zu transformieren. Das aus diesen Transformanten isolierte Plasmid wurde durch Restriktionsanalyse verifiziert und die Gensequenz durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Das Plasmid mit der richtigen Sequenz, pET20b-Tfu_0882 oder pET20b-Tfu_0883, wurde verwendet, um chemisch kompetente E. coli BL21 Rossetta (DE3) PlysS-Zellen zu transformieren.
Die E. coli Rossetta (DE3) pLysS-Zellen, die pET20b-Tfu_0883 beherbergen, wurden in TB-Medium, das Ampicillin (100 mg / Liter) und Chloramphenicol (50 mg/Liter) enthielt, bei 37 ° C unter Schütteln bei 200 U / min gezüchtet. Β-d-thiogalactosid-isopropyl wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,4 mm zugegeben, wenn die Kultur einen A600 von 1,5 erreichte. Der Kulturüberstand wurde 16 h nach Induktion durch Zentrifugation (40.000 ×g, 20 min, 4°C) gesammelt.
Der Kulturüberstand wurde eingeengt und gegen 2 Liter Puffer B (20 mm Natriumphosphat, 0,5 m NaCl, 20 mm Imidazol, pH 7,4) über Nacht dialysiert und auf eine mit Puffer B voräquilibrierte Nickelaffinitätssäule aufgebracht. Die Säule wurde mit einer Flussrate von 1,0 ml/min unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 480 mm Imidazol in Puffer B über 100 min eluiert. Die Fraktionen mit pNPB-Hydrolase-Aktivität wurden gepoolt und gegen 2 Liter Puffer C (20 mm Tris-HCl, pH 8,0) bei 4°C über Nacht dialysiert. Das gereinigte Enzym wurde aliquotiert und bei -80°C gelagert. Die Expression und Reinigung von rekombinantem Tfu_0882 wurde unter Verwendung der gleichen Verfahren wie oben für Tfu_0883 beschrieben durchgeführt.
Reinigung von rekombinanter F. solani pisi Cutinase — Die B. subtilis, die das Plasmid pBSMuL3 enthält, das F. solani pisi cutinase exprimiert, wurde in TB-Medium, das Kanamycin (50 mg / Liter) enthielt, bei 37 ° C unter Schütteln bei 200 U / min über Nacht gezüchtet. Der Kulturüberstand wurde durch Zentrifugation gesammelt (40.000 × g, 20 min, 4°C). Der Kulturüberstand wurde mit festem (NH4)2SO4 bis zu einer Endkonzentration von 70% (w/v) versetzt. Die ausgefallenen Proteine wurden durch Zentrifugation (40.000 ×g, 30 min, 4°C) gesammelt, in Puffer D (20 mm Tris-HCl, pH 7,5) gelöst und gegen 2 Liter Puffer D bei 4°C über Nacht dialysiert. Die dialysierte Probe wurde mit festem (NH4)2SO4 bis zu einer Endkonzentration von 20% (w/v) versetzt. Die Probe wurde filtriert (0,22 µm) und auf eine Phenyl-HP-Sepharose-FF-Säule geladen, die mit 20% (NH4)2SO4 in Puffer D voräquilibriert war. Ein umgekehrter Gradient von 20 auf 0% (NH4)2SO4 in Puffer D wurde mit einer Flussrate von 1,0 ml/min über einen Zeitraum von 60 min appliziert. Die Fraktionen mit pNPB-Hydrolase-Aktivität, die wie unten beschrieben untersucht wurde, wurden gepoolt, gegen 1 Liter Puffer E (20 mm Tris-HCl, pH 7,0) über Nacht dialysiert und auf eine mit Puffer E voräquilibrierte CM-Sepharose-Säule geladen. Die Säule wurde mit einer Flussrate von 0,5 ml/min unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 1 m NaCl in Puffer E über 30 min eluiert. Die Fraktionen mit pNPB-Hydrolase-Aktivität wurden gepoolt und gegen 500 ml Puffer E über Nacht bei 4°C dialysiert. Das gereinigte Enzym wurde aliquotiert, blitzgefroren und bei -80°C gelagert.
Enzym—Assays-Die Esterase-Aktivität wurde durch einen kontinuierlichen spektrophotometrischen Assay unter Verwendung von pNPB als Substrat bestimmt (22). Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die Produktion von 1 µmol p-Nitrophenol pro Minute. Der Standardassay wurde in einem Endvolumen von 1 ml mit pNPB (1 mm), dem Enzym und dem Assaypuffer (20 mm Tris-HCl, 10 mm NaCl und 50 mm Natriumtaurodeoxycholat, pH 8,0) bei 20°C gemessen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von pNPB initiiert. Die Hydrolyse von pNPB wurde spektrophotometrisch auf die Bildung des p-Nitrophenols bei 405 nm überwacht.
Die Cutinase-Aktivität wurde wie zuvor berichtet mit der folgenden Modifikation bestimmt (20). Als Substrat diente Apfelcutin, hergestellt aus reifen Äpfeln wie zuvor beschrieben (2). Für einen typischen Test wurden eine bestimmte Menge Enzym und 100 mg Apfelcutin in einen 25 mm Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) in einem Endvolumen von 10 ml gegeben. Das Rohr wurde 18 h in einem auf die gewünschten Temperaturen voreingestellten Wasserbad geschüttelt (125 U/min). Am Ende der Reaktion wurde das verbleibende Cutin durch Zentrifugation entfernt. Der entstandene Überstand wurde mit Essigsäure angesäuert und die freigesetzten Cutinmonomeren mit Chloroform extrahiert. Das organische lösliche Material wurde gesammelt und im Stickstoffstrom getrocknet. Die getrockneten Cutinmonomeren wurden in ihre entsprechenden Methylester überführt und anschließend mit Bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid silyliert (23). Die silylierten Methylester wurden in Hexan gelöst und mit Finnigan GC/MS 4610B auf einer 122-7032 DBWAX 30M Kapillarsäule mit folgender Temperaturprogrammierung analysiert: 125 °C für 5 min, 4 °C/min bis 250 °C und 250 °C für 15 min.
Die Lipaseaktivität wurde wie zuvor berichtet (24) mit der folgenden Modifikation gemessen. Triolein diente als Substrat. Die Reaktionslösung enthielt 2,5 ml 25 mm Kaliumphosphatpuffer (pH 8) und 2 ml emulgiertes Triolein (3% PVA:Triolein = 3:1). Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms zur Reaktionslösung initiiert und durch Zugabe von 7,5 ml Ethanol gequencht. Die freigesetzten Fettsäuren wurden durch Titration mit 0,05 n NaOH quantifiziert. Eine Einheit der Lipaseaktivität wurde als Freisetzung von 1 µmol Fettsäure pro min definiert.
Temperatur- und pH-Abhängigkeit der Cutinase – Die Temperaturabhängigkeit der Enzymaktivität wurde zwischen 20 und 70 °C bestimmt. Für die Esteraseaktivität wurde die Reaktion in einem Puffer mit 20 mm Tris-HCl, 10 mm NaCl und 50 mm Natriumtaurodeoxycholat bei pH 8,0 unter Verwendung von pNPB als Substrat durchgeführt. Da der pH-Wert des Tris-Puffers temperaturabhängig ist, wurden die Puffer auf pH 8,0 bei den gewünschten Temperaturen eingestellt. Die Enzymaktivität wurde gemessen, indem der Puffer 2 min lang bei einer gewünschten Temperatur vorinkubiert wurde, damit er den endgültigen pH-Wert von 8,0 erreichen konnte. Zur Lipaseaktivität wurde die Reaktion in 25 mm Kaliumphosphat (pH 8,0) unter Verwendung von Triolein als Substrat durchgeführt. Die pH–Abhängigkeit der Enzymaktivität wurde zwischen pH 6,0 und 9,0 entweder mit 25 mm Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0-7,0) oder 20 mm Tris–HCl-Puffer (pH 7,0-9,0) bestimmt.
Thermostabilität der Cutinase – Die Thermostabilität des Enzyms wurde durch Inkubation des Enzyms in 20 mm Tris-HCl (pH 8,0) bei 40 oder 60°C bestimmt. Zu verschiedenen Zeiten wurden Aliquots von Enzymen entfernt und unter Verwendung von pNPB als Substrat auf Restaktivität untersucht.
Bewertung des potenziellen synergistischen Effekts zwischen Tfu_0882 und Tfu_0883 — Um die Möglichkeit eines Synergismus zwischen den beiden T. fusca-Cutinasen beim Cutinabbau zu bewerten, wurden Tfu_0882 (0,08 µmol) und Tfu_0883 (0,08 µmol) entweder einzeln oder als 1: 1-Mischung mit 1% (w / v) Apfelcutin in 25 mm Kaliumphosphat inkubiert puffer (pH 8,0) bei 60°C Zu verschiedenen Zeiten wurden Aliquots entnommen und durch Titration mit 0,02 n NaOH auf Fettsäuren untersucht. Die nach 18 h Inkubation freigesetzten Fettsäuremonomere wurden wie oben beschrieben mittels GC/MS identifiziert.
Inaktivierung der Cutinase—Die Inaktivierung des Enzyms erfolgte durch Inkubation des Enzyms (2 µm) mit 1 mm PMSF in 20 mm Tris-HCl (pH 7,0) bei 37°C für unterschiedliche Zeiträume. Die Inaktivierungsreaktionen wurden durch 200-fache Verdünnung in eiskalten Standard-Esterase-Assay-Puffer wie oben beschrieben gestoppt. Die restliche Enzymaktivität wurde sofort durch Standard-Esterase-Assay unter Verwendung von pNPB als Substrat bestimmt. In Kontrollexperimenten wurde gezeigt, dass die Inaktivierung während des Assays unter diesen Bedingungen nicht ablief (Daten nicht gezeigt). Die Konzentrationsabhängigkeit der PMSF-Hemmung wurde analog unter Verwendung einer Inaktivierungszeit von 10 min durchgeführt.
Erzeugung von Cutinase-Mutanten – Cutinase-Mutationen wurden mit der Standardmethode der QuikChange-Mutagenese unter Verwendung komplementärer Primer erzeugt. Die S188A-Mutante von Tfu_0882 wurde unter Verwendung von pET20b-Tfu_0882 als Vorlage generiert; Die S170A-Mutante von Tfu_0883 wurde unter Verwendung von pET20b-Tfu_0883 als Vorlage generiert. Mutierte Sequenzen wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert. Die Expression und Reinigung der Mutanten erfolgte nach den gleichen Verfahren wie für die ursprünglichen rekombinanten T. fusca-Cutinasen beschrieben. Die Esteraseaktivität der gereinigten Mutanten wurde mit pNPB als Substrat bestimmt.
Verschiedene Methoden – Die optische Spektroskopie wurde mit dem ultraviolett-sichtbaren Spektralphotometer UV-2450 der Firma Shimadzu durchgeführt. SDS-PAGE wurde unter reduzierenden Bedingungen an einem 12%igen Polyacrylamidgel durchgeführt. Das Gel wurde mit 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250 Färbung visualisiert. Die Proteinkonzentration wurde nach der Bradford-Methode bestimmt.